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人胰島素(INS)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明書

發布時間:2023-02-08   點擊次數:373次

人胰島素(INS)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明書

l該試劑盒用于體外定量檢測人 血清、血漿或其他相關生物液體中INS的濃度。

 

實驗原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被有人胰島素(INS)捕獲抗體的微孔中,依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體,HRP酶結合物,中間經過溫育和洗滌,用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素(INS)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。

試劑盒組成:

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

預包被96孔酶標板

Pre-coated Assay Plate

8孔×12條

8孔×6條

標準品

Standard

2支

1支

按說明書進行稀釋

通用稀釋液

Universal Diluent

2x20mL

1x20mL

濃縮生物素化檢抗100×

Biotin-antibody (100×)

120μL

60μL

按說明書進行稀釋

濃縮酶結合物100×

Streptavidin-HRP (100×)

120μL

60μL

按說明書進行稀釋

20×洗滌液

Wash Buffer (20×)

2x10mL

1x10mL

按說明書進行稀釋

底物(TMB)

TMB Substrate

10mL

5mL

終止液

Stop Solution

6mL

3mL

封板膜

Plate Sealer

4張

4張

說明書

Instruction Manual

1份

1份


試劑盒參數:

性能


靈敏度

0.076ng/mL

檢測范圍

0.156-10ng/mL

重復性

板內變異系數小于10%,板間變異系數小于10%。

特異性

可檢測樣本中人的INS,且與其類似物無明顯交叉反應

 

需自備的設備及試劑: 

1. 450±10nm 濾光片酶標儀

2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準備若干個標準品稀釋管.


樣本處理及要求:

1. 血清:將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,然后1000×g離心20分鐘,取上清即可,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

2. 血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

3. 組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

4. 細胞培養物上清:請1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

5. 其它生物標本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測。

6. 樣品外觀:樣品應清澈透明,懸浮物應離心去除。

7. 樣品保存:樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個月內檢測),或-80℃(6個月內檢測),避免反復凍融,標本溶血會影響最后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

 

檢測前準備工作:

1. 提前從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。

2. 標準品梯度工作液配制:加入1mL通用稀釋液至凍干標準品中,靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為10ng/mL),然后按照以下濃度:10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、 0.312ng/mL、0.156ng/mL、0ng/mL進行稀釋。倍比稀釋方法:取7支 EP管,每管中加入500μL通用稀釋液,10ng/mL的標準品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成5ng/mL的標準品工作液,按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔,不需要再從倒數第二管中吸取液體,具體如下圖。


3. 生物素化檢抗工作液配制:使用前15分鐘將濃縮生物素化抗體于1000×g離心1分鐘,以通用稀釋液將100×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作濃度(例:10μL濃縮液+990μL通用稀釋液),當日使用。

4. 酶結合物工作液配制:使用前15分鐘將100x濃縮酶結合物于1000×g離心1分鐘,以通用稀釋液將100×濃縮HRP酶結合物稀釋成1×工作濃度(例:10μL濃縮液+990μL通用稀釋液),當日使用。

5. 1×洗滌液配制:取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中(從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬于正?,F象,可放置室溫,輕搖均勻,待結晶溶解后再配置)。

 

操作步驟:


1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 加樣:分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl每孔加入相應孔中,空白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時。(建議:將待測樣本用通用稀釋液低稀釋1倍后再加入酶標板內測試。從而減少基質效應對測試結果的誤差影響,最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔)。

3. 加生物素化抗體:取出酶標板,棄去液體,不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液100μL,蓋上封板膜后37℃溫育1小時。

4. 洗板:棄去液體,每孔加入300μL 1x洗滌液,靜置1分鐘,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板3次(也可用洗板機洗板)。

5. 加酶結合物工作液:每孔加入酶結合物工作液100μL,蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘。

6. 洗板:棄去液體按步驟4洗滌方法,洗板5次。

7. 加底物:每孔加入底物(TMB)90μL,蓋上封板膜,37℃避光溫育15分鐘。

8. 加終止液:取出酶標板,每孔直接加入終止液50μL,立即在450nm波長處測定各孔的OD值。


結果判斷:

1. 計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。

典型數據和參考曲線:

以下數據和曲線僅供參考,實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

濃度(ng/mL)

10

5

2.5

1.25

0.625

0.312

0.156

0

OD值

2.22

1.56

0.92

0.63

0.42

0.25

0.18

0.08

校正OD值

2.14

1.48

0.94

0.55

0.34

0.17

0.1

-

 

 

 



試劑盒性能:

1. 重復性:板內變異系數小于10%,板間變異系數小于10%。

2. 回收率:在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入3個不同濃度水平的人INS,計算回收率

樣本類型

范圍

平均回收率

血清(n=8)

84-101

96

血漿(n=8)

92-105

102

細胞培養上清(n=8)

96-108

105

 

 

 

 

 

 

3. 線性稀釋:分別在選取的4份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人INS,在標準曲線動力學范圍內進行稀釋,評估線性。評估線性。

稀釋比例

回收率(%)

血清

血漿

細胞培養上清

1:2

范圍(%)

84-95

88-96

90-110

平均回收率(%)

91

93

96

1:4

范圍(%)

89-103

87-108

105-115

平均回收率(%)

94

98

108


注意事項:

1. 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,已經變藍的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9. 不能使用過期產品。

10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。



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